高效液相色譜(簡(jiǎn)稱 HPLC)是一種用途廣泛、分析能力極強(qiáng)的色譜技術(shù),在藥物生產(chǎn)和研究的許多方面都有應(yīng)用。它根據(jù)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和成分,將混合物分離或識(shí)別為不同的成分。
HPLC 應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)。它非常靈敏、特異和精確。
它是柱層析的一種特殊形式,用于生物化學(xué)和分析,以分離、鑒定和量化混合物中的活性化合物。
在 HPLC 上有填料(固定相),泵使流動(dòng)相通過色譜柱,檢測(cè)器顯示分析物的保留時(shí)間。
保留時(shí)間是可變的,主要取決于固定相、分析物和所用溶劑之間的相互作用。
少量待分析樣品被引入流動(dòng)相流,并通過與固定相的特定化學(xué)或物理相互作用而被保留
保留取決于分析物的性質(zhì)以及固定相和流動(dòng)相的成分。
高效液相色譜法(HPLC)最常用的有機(jī)溶劑是甲醇和乙腈。
高效液相色譜儀(HPLC)是一種以液體為流動(dòng)相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有顆粒極細(xì)的高效固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)的儀器。其原理為色譜法的分離原理,即溶于流動(dòng)相的各組分經(jīng)過固定相時(shí),由于與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同,在固定相中滯留時(shí)間不同,從而先后從固定相中流出。高效液相色譜法(HPLC)是將少量液體樣品注入裝有微小顆粒(直徑為 3 ~5 um,稱為固定相)的柱子中,樣品中的單個(gè)成分隨著通過泵輸送的高壓液體(流動(dòng)相)通過色譜柱進(jìn)入裝有顆粒的柱子。柱填料用于將成分相互分離。這涉及到其分子與填料顆粒之間的各種化學(xué)和/或物理相互作用。分離出來的成分會(huì)在色譜柱出口處被檢測(cè)器檢測(cè)到,檢測(cè)器會(huì)測(cè)量這些成分的含量。檢測(cè)器的輸出稱為 "液相色譜圖"。
與傳統(tǒng)的低壓柱液相色譜法相比,高效液相色譜法(HPLC)有許多優(yōu)勢(shì)。
· 靈敏度更高(可使用各種檢測(cè)器)
· 更高的分辨率
· 速度更快
· 便于樣品回收(移除的流動(dòng)相更少)
· 多種固定相可適用
圖 2.描述色譜法的分支。
HPLC 的以下變體取決于工藝中的相系統(tǒng)(固定相)。
(1)正相高效液相色譜法
又稱正相色譜法或吸收色譜法。這種方法根據(jù)極性分離分析物。它有一個(gè)極性固定相和非極性流動(dòng)相。因此,固定相通常為二氧化硅,典型的流動(dòng)相為正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。該技術(shù)適用于對(duì)水敏感的化合物、幾何異構(gòu)體、順反異構(gòu)體、類別分離和手性化合物。
(2)反相高效液相色譜法
固定相為非極性(疏水性),流動(dòng)相為水性、中等極性。它的工作原理是疏水相互作用,因此材料的非極性越強(qiáng),保留時(shí)間就越長(zhǎng)。這種技術(shù)適用于非極性、極性、可電離和離子分子。
(3)體積排阻高效液相色譜法
又稱凝膠滲透色譜法或凝膠過濾色譜法。色譜柱中填充有精確控制孔徑的材料,顆粒根據(jù)分子大小被分離。較大的分子迅速通過色譜柱;較小的分子則穿過多孔填料顆粒,隨后洗脫出來。體積法還有助于確定蛋白質(zhì)和氨基酸的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。它還可用于測(cè)定多糖的分子量。
(4)離子交換高效液相色譜
在這種色譜法中,保留是基于溶質(zhì)離子與固定相上的帶電位點(diǎn)之間的吸引力。帶相同電荷的離子會(huì)被排除在外。這種技術(shù)可用于純化水、蛋白質(zhì)的配體和離子交換色譜、碳水化合物和低聚糖的高 pH 陰離子交換色譜等。
(5)生物親和高效液相色譜
在這類色譜中,分離是基于蛋白質(zhì)與配體的可逆相互作用。
系統(tǒng)的核心是進(jìn)行色譜分離。儀器有以下幾個(gè)模塊組成:
(1)溶劑儲(chǔ)液器:玻璃儲(chǔ)液器中含有流動(dòng)相內(nèi)容物。高效液相色譜法中的流動(dòng)相或溶劑通常是極性和非極性液體成分的混合物,其各自的濃度根據(jù)樣品的成分而變化。
(2)泵:泵將流動(dòng)相從溶劑儲(chǔ)液器中吸出,并迫使其通過系統(tǒng)的色譜柱和檢測(cè)器。根據(jù)色譜柱的尺寸、固定相的粒度、流速和流動(dòng)相的成分等因素,工作壓力最高可達(dá) 42000 kPa(約 6000 psi)。
(3)樣品進(jìn)樣器:進(jìn)樣器可以是單次進(jìn)樣,也可以是自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)。用于高效液相色譜系統(tǒng)的進(jìn)樣器應(yīng)能在高壓(高達(dá) 40Mpa)條件下對(duì)體積在 0.1-100 uL 范圍內(nèi)的液體樣品進(jìn)行進(jìn)樣,并具有較高的重現(xiàn)性。
(4)色譜柱:色譜柱通常由拋光不銹鋼制成,長(zhǎng)度在 50 至 300 毫米之間,內(nèi)徑在 2 至 5 毫米之間。色譜柱通常填充粒徑為 3-10 微米的固定相。內(nèi)徑小于 2 毫米的色譜柱通常稱為微孔色譜柱。正常情況下,流動(dòng)相和色譜柱的溫度在分析過程中應(yīng)當(dāng)保持恒定。
(5)檢測(cè)器:高效液相色譜檢測(cè)器位于色譜柱的末端,在分析物從色譜柱洗脫出來時(shí)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。常用的檢測(cè)器有紫外光譜檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器、示差檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器。
(6)數(shù)據(jù)收集裝置:檢測(cè)器發(fā)出的信號(hào)可收集到圖表記錄器或電子積分器上,它們的復(fù)雜程度和處理、存儲(chǔ)和再處理色譜數(shù)據(jù)的能力各不相同。計(jì)算機(jī)將檢測(cè)器對(duì)每種成分的響應(yīng)進(jìn)行整合,并將其放入色譜儀中,以便于讀取和解釋。
高效液相色譜法可獲得的信息包括化合物的分辨、鑒定和定量。它還有助于化學(xué)分離和純化。高效液相色譜的其他應(yīng)用包括
· 制藥應(yīng)用:控制藥物穩(wěn)定性。藥物劑型的片劑溶出度研究。藥品質(zhì)量控制
· 環(huán)境應(yīng)用:檢測(cè)飲用水中的酚類化合物。污染物的生物監(jiān)測(cè)。
· 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用:生物樣本中的藥物定量。鑒定血液、尿液等中的類固醇。紡織品染料的法醫(yī)分析。測(cè)定血液、尿液等中的可卡因和其他濫用藥物。
· 食品和香料:軟飲料和水的質(zhì)量測(cè)定。果汁中的糖分分析 蔬菜中多環(huán)化合物的分析。防腐劑分析。
· 在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用:尿液分析、血液中的抗生素分析。肝臟疾病中膽紅素和膽綠素的分析。檢測(cè)腦細(xì)胞外液中的內(nèi)源性神經(jīng)肽等。