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液相方法開發(fā)-01

HPLC (高效液相色譜法) 由于具有分析速度快、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、精密性好以及易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),使其成為檢測(cè)、分離和定量領(lǐng)域最常用的分離技術(shù)。為了優(yōu)化 HPLC 方法,我們需要研究多個(gè)色譜參數(shù),包括:樣品前處理、流動(dòng)相選擇、色譜柱選擇和檢測(cè)器選擇。本文的目的是介紹方法開發(fā)、優(yōu)化和驗(yàn)證流程。

建立分析方法的流程包括:色譜條件優(yōu)化和了解分析物的理化性質(zhì)。隨后的步驟包括樣品制備、方法改進(jìn)和方法驗(yàn)證,以確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠。

 

了解分析物的理化性質(zhì)

在為分析物制定分析方法時(shí),了解其理化性質(zhì)至關(guān)重要。首先考慮的因素包括分析物的 pH 值、極性、溶解度和 pKa。極性是一個(gè)關(guān)鍵的物理性質(zhì),它指導(dǎo)著溶劑和流動(dòng)相組分的選擇。分析物的溶解度與極性相關(guān),遵循“相似相溶”的原則。流動(dòng)相或稀釋劑的選擇則受分析物溶解度的影響,以確保兼容性。分析物不能與 HPLC 系統(tǒng)成分發(fā)生反應(yīng),且能溶解。Ph  pKa 等參數(shù)在 HPLC 方法開發(fā)中至關(guān)重要,影響著溶劑的選擇和整個(gè)方法的成功與否。

HPLC,針對(duì)可電離的分析物,優(yōu)化 pH 值往往能獲得尖銳、對(duì)稱的色譜峰。在定量分析中,要獲得低檢測(cè)限、低進(jìn)樣偏差和穩(wěn)定保留時(shí)間,確保精確測(cè)量和可靠結(jié)果所需的精度和靈敏度,尖銳且對(duì)稱的色譜峰至關(guān)重要。

優(yōu)化色譜條件

在方法開發(fā)初始階段,需要確定一套條件,包括檢測(cè)器、色譜柱和流動(dòng)相,并生成樣品的“初始”色譜圖。通常使用帶有紫外檢測(cè)功能的 C18 色譜柱進(jìn)行反相分離。在這一階段,需要決定是:開發(fā)梯度方法還是等度方法,這兩種方法都具有不同的優(yōu)勢(shì),具體取決于分離要求和分析物的性質(zhì)。

液相方法開發(fā)-02

選擇色譜柱

色譜柱是色譜儀的核心,在實(shí)現(xiàn)可靠、準(zhǔn)確的分析中起著舉足輕重的作用。選擇好的色譜柱可確保良好的色譜分離效果,從而獲得值得信賴的結(jié)果。反之,色譜柱選擇不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致分離不充分和混亂,使結(jié)果無效或難以解釋。

在方法開發(fā)過程中,改變色譜柱會(huì)極大地影響待測(cè)物的分離度。粒度、保留能力、固定相化學(xué)成分和色譜柱尺寸等因素對(duì)于選擇適合特定分析應(yīng)用的理想色譜柱至關(guān)重要。色譜柱的三個(gè)基本組成部分是:硬件、填料和固定相。氧化鋁、鋯、聚合物以及最常見的硅膠等填料作為固定相的載體。硅膠因其強(qiáng)度高、球形大小一致、易于衍生和耐壓而受到青睞。在選擇理想的色譜柱時(shí),需要考慮的因素包括顆粒大小、保留能力、固定相化學(xué)成分和色譜柱尺寸。這些因素共同影響著色譜柱在特定分析應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確可靠分離的效率和效果。

硅膠在大多數(shù)有機(jī)溶劑和低 pH 值環(huán)境中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。然而,其缺點(diǎn)是傳統(tǒng)的硅膠在 pH 值超過 7 時(shí)會(huì)分解。所以說色譜柱選擇時(shí)也需要主要PH適用范圍(注:色譜柱說明書上有ph適用范圍),否則選擇不合適的色譜柱進(jìn)行使用會(huì)導(dǎo)致色譜柱壽命大打折扣。硅膠的成分、形狀和粒度均會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生影響。一般來說,粒度越大,理論塔板數(shù)越多。正相或反相色譜柱的適用性取決于所采用的固定相類型,這凸顯了硅膠色譜柱在各種色譜應(yīng)用中的多功能性。

正相色譜涉及使用極性固定相和非極性流動(dòng)相,極性分子的洗脫時(shí)間通常晚于非極性分子。在反相色譜中,色譜柱的選擇至關(guān)重要。例如,丙基色譜柱(C3)、丁基色譜柱(C4)和戊基色譜柱(C5)對(duì)具有疏水殘基的大分子和肽類物質(zhì)非常有利,尤其是在離子對(duì)色譜法(C4)中。不過,與 C8 或 C18 固定相相比,C3-C5 色譜柱保留非極性分析物的效果通常較差。這些色譜柱化學(xué)成分的變化使得在色譜分析中可以對(duì)不同化合物進(jìn)行定制化分離。

YMC-Pack C4、Luna C5 和 Zorbax SBC3 等反相色譜柱代表了反相色譜柱的特點(diǎn)。不過,與烷基鏈較長(zhǎng)的色譜柱相比,烷基鏈較短的色譜柱(如 C4 和 C5)可能具有較低的抗水解性。辛基(C8)相在各種應(yīng)用中都很有用,對(duì)類固醇、核苷和藥物等化合物具有優(yōu)勢(shì),但其保留性不如 C18 相。固定相或色譜柱的選擇在方法開發(fā)中至關(guān)重要,因?yàn)槿绻麤]有可靠、高性能的色譜柱,就很難建立可重現(xiàn)的程序。穩(wěn)定性和可重現(xiàn)性對(duì)于避免在方法開發(fā)過程中出現(xiàn)樣品保留問題至關(guān)重要。影響這種差異的關(guān)鍵因素包括鍵合固定相的參數(shù)、硅膠填料的特性以及色譜柱的直徑。硅膠填料因其有利的物理特性而成為現(xiàn)代色譜柱的首選,在實(shí)現(xiàn)分析應(yīng)用的多樣化和精確分離方面具有多功能性和高效性。

色譜柱選擇時(shí)也需要主要PH適用范圍(注:色譜柱說明書上有ph適用范圍),否則選擇不合適的色譜柱進(jìn)行使用會(huì)導(dǎo)致色譜柱壽命大打折扣。

分離模式選擇

分離模式由分析物的極性和分子量決定。在實(shí)際應(yīng)用中,反相色譜法(RPC)尤其適用于小型有機(jī)化合物。反相色譜廣泛用于分離酸堿等可電離物質(zhì),采用離子對(duì)試劑或含緩沖鹽流動(dòng)相來防止分析物發(fā)生電離。

 

液相方法開發(fā)--03

等度/梯度模式選擇

探索梯度是指:在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)(標(biāo)準(zhǔn)為 20 分鐘),從約 5-10的 %B(B;一般為有機(jī)相)  100 %B 的線性梯度。洗脫強(qiáng)度在 100% B 時(shí)保持幾分鐘,以確保所有樣品組分都已洗脫。對(duì)于反相梯度洗脫,通常選擇水(或緩沖液,如果有可電離的分析物)和乙腈作為流動(dòng)相。使用易揮發(fā)的緩沖液(如甲酸銨)可使方法與用于 LC-MS 的質(zhì)譜兼容。從色譜圖中可以看出很多有關(guān)流動(dòng)相組成、色譜柱化學(xué)成分和分離所需的分析模式的信息。如果化合物在梯度結(jié)束后的洗脫時(shí)間超過梯度時(shí)間的 25%,則需要使用更強(qiáng)的 B 溶劑或保留性更差的色譜柱進(jìn)行分析。此外,公式 1(其中 tG 為檢測(cè)梯度時(shí)間,△t為第一個(gè)峰至最后一個(gè)峰所需要的時(shí)間),△t/ tG 0.25一般選擇等度分析,反之選擇梯度模式更為合適,可用于確定是否可以進(jìn)行等度分離;這始終是首選,因?yàn)樗商岣邩悠返姆治鐾浚o需重新平衡時(shí)間)并簡(jiǎn)化分析。在建立梯度時(shí),應(yīng)將洗脫出第一個(gè)峰的流動(dòng)相成分作為初始流動(dòng)相成分或者也可做為稀釋劑。

流動(dòng)相的選擇以及優(yōu)化

盡量選擇毒性小的溶劑,我們應(yīng)該了解常用試劑的MSDS,尤其了解其毒性以及如何處理突發(fā)情況。

2.然后我們選的溶劑之間是相互互溶的。

3.與檢測(cè)器匹配:紫外:流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)要低于樣品的檢測(cè)波長(zhǎng);RI:流動(dòng)相的折光系數(shù)與樣品的差異較大;ELSD:揮發(fā)性或受熱分解成氣體的流動(dòng)相;質(zhì)譜:能促進(jìn)相應(yīng)離子源模式下化合物的電離。

4.粘度低:高粘度溶劑會(huì)影響傳質(zhì)和擴(kuò)散,降低柱效,柱壓會(huì)高。

5.流動(dòng)相pH:反相模式下,對(duì)于可電離的化合物,應(yīng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH使待測(cè)物不電離,處于分子狀態(tài)。一般酸性分析物使用流動(dòng)相pH比分析物酸度系數(shù)更低的流動(dòng)相,堿性分析物使用流動(dòng)相pH比分析物酸度系數(shù)更高的流動(dòng)相。

 

6.流動(dòng)相中的緩沖鹽:應(yīng)考慮緩沖鹽在有機(jī)相中的溶解度,一般運(yùn)行梯度不會(huì)超過70%有機(jī)相,防止泵頭處鹽析,應(yīng)考慮將B相配制成有機(jī)相與水混合溶液。

7.離子對(duì)試劑能不用盡量不用,如果用的話,盡量專柱專用,因?yàn)殡x子對(duì)會(huì)使色譜柱填料改性。

8.流動(dòng)相的純度,HPLC用色譜純有機(jī)相,水用二次純水或屈臣氏蒸餾水,質(zhì)譜需用質(zhì)譜純的有機(jī)相和水。

9.不能對(duì)色譜系統(tǒng)造成損壞,比如二氯甲烷會(huì)腐蝕泵的金屬組件,可與其他試劑預(yù)混后使用,用完要及時(shí)置換系統(tǒng);堿性流動(dòng)相會(huì)對(duì)普通色譜柱的硅膠溶解塌陷,有機(jī)雜化的硅膠對(duì)堿性環(huán)境的穩(wěn)定性更好一些。

10.不對(duì)樣品造成破壞。

另外對(duì)于制備色譜的流動(dòng)性有兩點(diǎn)補(bǔ)充:

1.對(duì)樣品有一定的溶解性,如果對(duì)樣品的溶解性差,會(huì)導(dǎo)致樣品析出,會(huì)影響分離,甚至堵塞進(jìn)樣器或色譜柱。

2.揮發(fā)性好、沸點(diǎn)低,利于分離后的餾分后處理。

? pH 值的影響

對(duì)于可電離的分析物,根據(jù)分析物的 pKa 值確定合適的流動(dòng)相 pH 值至關(guān)重要。這可確保目標(biāo)分析物處于中性或離子化狀態(tài)。調(diào)節(jié)流動(dòng)相 pH 值是優(yōu)化分離的重要方法。pH 值調(diào)節(jié)在調(diào)整色譜條件以實(shí)現(xiàn)理想的分離效果方面起著至關(guān)重要的作用。

? 有機(jī)相的影響

為反相 HPLC 選擇有機(jī)相通常很簡(jiǎn)單,最常用的是乙腈和甲醇(偶爾也用 四氫呋喃)。在溶劑強(qiáng)度保持不變的等度條件下,要使復(fù)雜的多組分樣品中的每種成分都得到最佳的洗脫效果,可能具有挑戰(zhàn)性。因此,通常采用梯度洗脫,允許在 k(保留因子)1 到 10 之間改變有機(jī)相成分。這種動(dòng)態(tài)方法可提高分離效率,尤其適用于 HPLC 中的復(fù)雜混合物。

檢測(cè)器和波長(zhǎng)的選擇

色譜分離后,使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行鑒定。液相色譜(LC)中常見的檢測(cè)器包括:紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、示差檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器。

檢測(cè)器的選擇受樣品性質(zhì)和分析目標(biāo)的影響。例如,在多組分分析中,吸收光譜可能會(huì)比母體化學(xué)物質(zhì)的吸收光譜波長(zhǎng)更長(zhǎng)或更短,這就影響了選擇合適的檢測(cè)器來進(jìn)行準(zhǔn)確和有選擇性的鑒定。

LC 分析中,檢測(cè)器的選擇對(duì)達(dá)到所需的靈敏度和特異性起著至關(guān)重要的作用。在紫外檢測(cè)中,目標(biāo)分析物和雜質(zhì)的光譜必須在不同波長(zhǎng)下采集、疊加,然后進(jìn)行歸一化處理。選擇波長(zhǎng)對(duì)于確保大多數(shù)分析物都有足夠的響應(yīng),從而在液相色譜中進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)至關(guān)重要。仔細(xì)考慮不同波長(zhǎng)的紫外光譜可確保分析方法對(duì)樣品中的所有相關(guān)成分都很敏感,從而提高分析的精確度和可靠性。

創(chuàng)建分析方法

反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分析方法開發(fā)的初始階段包括選擇各種色譜參數(shù),如流動(dòng)相、色譜柱、流動(dòng)相流速和流動(dòng)相 pH 值。通過試驗(yàn),對(duì)每個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,然后與系統(tǒng)適用性參數(shù)進(jìn)行比較。典型的參數(shù)包括:保留時(shí)間超過 5 分鐘、理論板數(shù)超過 2000 板、拖尾因子小于 2、分辨率大于 5 以及標(biāo)準(zhǔn)色譜中分析峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (R.S.D.) 不超過 2%。這些參數(shù)確保了 RP-HPLC 方法的可靠性和精確性。

樣品制備

樣品制備是高效液相色譜(HPLC)分析的關(guān)鍵步驟,可確保獲得均勻且可重復(fù)的溶液注入色譜柱。樣品制備的目的是:制備出與色譜柱兼容且與所需 HPLC 方法相匹配的無干擾等分樣品。這就需要選擇能溶解在流動(dòng)相中而不影響保留或分辨率的樣品溶劑。樣品制備的初始步驟包括:收集樣品并將其注入色譜柱,為準(zhǔn)確可靠的色譜分析奠定基礎(chǔ)。識(shí)別方法中的弱點(diǎn),并采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來增強(qiáng)它。評(píng)估該方法對(duì)各種樣品、設(shè)備配置和環(huán)境因素的影響。這一迭代過程有助于完善方法,確保 HPLC 分析在不同條件下的穩(wěn)定性、可靠性和適用性。

供試品溶液的濃度:分析方法的定量限應(yīng)當(dāng)≤報(bào)告限度。

稀釋劑:對(duì)于檢測(cè)方法無干擾,溶解性好、溶液穩(wěn)定、無溶劑效應(yīng)、經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

提取方式:超聲(功率,頻率,水溫),震搖-耐用性、溶液穩(wěn)定性。

稀釋劑體積:小規(guī)格制劑關(guān)注輔料所占比例。

溶液的處理:濾過(引入雜質(zhì),濾膜吸附),離心。

輔料:積分時(shí)空白輔料應(yīng)當(dāng)予以扣除,根據(jù)耐用性驗(yàn)證中空白輔料出峰時(shí)間擬定范圍,必要時(shí)標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)當(dāng)增訂空白輔料溶液進(jìn)樣,輔料與API的反應(yīng)。

 

驗(yàn)證

驗(yàn)證是評(píng)估和提供客觀證據(jù)的系統(tǒng)過程,證明滿足特定預(yù)期用途的具體要求。它包括評(píng)估方法的性能并證明其滿足特定標(biāo)準(zhǔn)的能力?;旧希?yàn)證可以讓您徹底了解您的技術(shù)可以可靠地產(chǎn)生什么結(jié)果,尤其是在處理痕量或 HPLC 等分析方法中存在挑戰(zhàn)性條件時(shí)。

初步驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)進(jìn)行:強(qiáng)制講解(分離度、物料平衡、峰純度)、耐用性、定量限、溶液穩(wěn)定性(雜質(zhì)儲(chǔ)備液、供試品溶液;對(duì)照品溶液)、準(zhǔn)確度。

方法驗(yàn)證

驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的過程,以證明分析方法的性能特征符合預(yù)期分析應(yīng)用的要求。無論是由多個(gè)操作人員在相同或不同的實(shí)驗(yàn)室中使用相同的設(shè)備,任何新的或更新的方法都必須經(jīng)過驗(yàn)證,以確保其始終產(chǎn)生可重復(fù)且可靠的結(jié)果。特定的方法及其預(yù)期用途決定了所需驗(yàn)證程序的類型,從而確保分析過程穩(wěn)健并適合各種環(huán)境下的目的。

方法驗(yàn)證結(jié)果是任何可靠分析程序的重要方面,提供對(duì)分析結(jié)果質(zhì)量、一致性和可靠性的評(píng)估。驗(yàn)證過程的關(guān)鍵是使用符合規(guī)格、經(jīng)過正確校準(zhǔn)、運(yùn)行正常且功能正常的設(shè)備。驗(yàn)證過程確保對(duì)分析方法進(jìn)行徹底評(píng)估,如果不符合要求的標(biāo)準(zhǔn),則驗(yàn)證方法可以使用或失效。這確保了各種應(yīng)用中分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

以下是FDA、USP和ICH推薦的典型參數(shù):

1.專屬性

2.線性范圍

3.精密度,包括方法精密度(重復(fù)性)和批內(nèi)批間精密度(重現(xiàn)性)

4.準(zhǔn)確度(回收率)

5.溶液穩(wěn)定性

6.檢測(cè)

7.定量限

8.可報(bào)告區(qū)間

9.系統(tǒng)適應(yīng)性

 

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