在日常分析檢測(cè)過程中,我們常常會(huì)準(zhǔn)備反相有機(jī)相做為流動(dòng)相;甲醇和乙腈被廣泛用作為有機(jī)溶劑。但是為什么有時(shí)候使用甲醇(Methanol),而有時(shí)候使用乙腈(Acetonitrile)呢?那這兩種有機(jī)溶劑之間有什么區(qū)別呢?我們就從以下幾個(gè)方面來進(jìn)行闡述。
一、化學(xué)性質(zhì)
·
乙腈是一種極性的不可電離非質(zhì)子酸,由于存在由于存在C≡N,它可以帶來π-π相互作用,又因?yàn)榈泳哂懈唠娯?fù)性,它也可以與另一分子形成氫鍵。甲醇是一種極性的可電離質(zhì)子酸,它可以和另一個(gè)分子相互作用形成氫鍵。為什么甲醇也可以形成氫鍵呢?因?yàn)榧状忌嫌?OH的存在,氧是高電負(fù)性原子,它可以部分極化分子。它在氧上產(chǎn)生微負(fù)電荷,在氫原子上產(chǎn)生微正電荷。因此,這個(gè)微正電荷的氫原子可以與微負(fù)電荷的原子形成氫鍵。
那么什么是極性可電離質(zhì)子溶劑?極性可電離質(zhì)子溶劑指的是具有氫原子與氧(如羥基)、氮(如胺基)或氟(如氟化氫)結(jié)合的溶劑。乙腈中存在氫原子,但這些氫原子不與氧形成氫鍵,因此,不能說乙腈是可電離的極性溶劑。而甲醇,氫原子可以與氧形成氫鍵,因此,甲醇是可電離極性溶劑。
·
二、截止波長(zhǎng)及吸光度
·
當(dāng)使用這兩種有機(jī)溶劑配制流動(dòng)相,選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),了解它們的紫外截止波長(zhǎng)是非常重要的。乙腈與甲醇相比,它的截止波長(zhǎng)更低,約為190nm,而甲醇約為210nm,這意味著使用乙腈時(shí)可以在190nm的低波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè),但使用甲醇作為有機(jī)溶劑,可能無法使用低于210nm的波長(zhǎng),因?yàn)榇藭r(shí)會(huì)產(chǎn)生很多基線噪音。(附圖:常用溶劑及緩沖鹽截止波長(zhǎng),如下:)
·
三、經(jīng)濟(jì)成本
·
另一個(gè)重要因素是甲醇和乙腈的經(jīng)濟(jì)成本。乙腈價(jià)格高于甲醇,因此當(dāng)有可能使用甲醇代替乙腈時(shí),可以使用甲醇以節(jié)省實(shí)驗(yàn)室成本。
四、有機(jī)溶劑比與柱壓的關(guān)系
我們的HPLC系統(tǒng)一般能承受的背壓約為40Mpa,超過這個(gè)數(shù)值泵就無法工作。因此,應(yīng)優(yōu)先選擇產(chǎn)生最小背壓的流動(dòng)相。有機(jī)溶劑和背壓之間存在怎樣的關(guān)系呢?在上圖中,使用色譜柱:ODS(150mm×4.6mm,5μm),流 速:1.0ml/min,比較了乙腈與水和甲醇與水混合物在不同條件的壓力。由于較高的溫度導(dǎo)致溶劑的粘度降低,壓力也趨向降低。將柱溫設(shè)置在25~40℃之間進(jìn)行比較,我們可以看到甲醇的壓力更高。因此,將流動(dòng)相中的乙腈替換為甲醇時(shí),需要重新評(píng)估儀器系統(tǒng)和色譜柱的耐壓能力。
五、乙腈&甲醇的溶劑強(qiáng)度比較
現(xiàn)在我們來了解一下這兩種重要有機(jī)溶劑的強(qiáng)度。圖3展示了使用ODS柱分離對(duì)羥基苯甲酸類化合物(即對(duì)羥基苯甲酸酯)的一個(gè)例子??梢钥闯霎?dāng)乙腈和甲醇以相同的比例與水混合時(shí),乙腈流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度更大。圖4中的等效溶劑強(qiáng)度示意圖有助于在這些溶劑之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換時(shí)近似計(jì)算洗脫強(qiáng)度。例如,如果我們先前使用的是50/50(體積比)的乙腈/水作為流動(dòng)相,在轉(zhuǎn)換為甲醇時(shí),等效的甲醇/水比例將為60/40(體積比)。
圖3中分析的是以下6種分析物:甲基對(duì)羥基苯甲酸酯,乙基對(duì)羥基苯甲酸酯,異丙基對(duì)羥基苯甲酸酯、丙基對(duì)羥基苯甲酸酯、異丁基對(duì)羥基苯甲酸酯以及正丁基對(duì)羥基苯甲酸酯。這些對(duì)羥基苯甲酸酯在甲醇中的流動(dòng)相中,它們都可以被有效地保留,但是當(dāng)換成到乙腈時(shí),保留時(shí)間會(huì)大大降低。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了乙腈在反相液相色譜中的洗脫能力更強(qiáng)。
那么為什么甲基對(duì)羥基苯甲酸酯會(huì)先洗脫出來,而正丁基對(duì)羥基苯甲酸酯卻最后才洗脫出來?看一下甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和丁基對(duì)羥基苯甲酸酯的結(jié)構(gòu),甲基對(duì)羥基苯甲酸酯的碳鏈長(zhǎng)度較短,而正丁基對(duì)羥基苯甲酸酯的碳鏈長(zhǎng)度較長(zhǎng)。碳鏈長(zhǎng)度的變化會(huì)影響化合物的非極性,碳鏈較短的化合物非極性較弱,因此在這種情況下,可以清楚地看到正丁基對(duì)羥基苯甲酸酯與甲基對(duì)羥基苯甲酸酯相比非極性更強(qiáng)。
我們使用的是Shim-Pack ODS色譜柱,C18色譜柱的保留是由疏水或非極性相互作用所決定的。非極性化合物會(huì)在C18固定相上相互作用或保留更長(zhǎng)時(shí)間,在這種情況下,由于正丁基對(duì)羥基苯甲酸酯具有更高的非極性特性,它會(huì)在C18固定相上保留更長(zhǎng)時(shí)間。
六、乙腈&甲醇洗脫選擇性的差異
圖5 甲醇和乙腈的選擇性差異
下一個(gè)重要的點(diǎn)是甲醇和乙腈之間的洗脫選擇性不同,我將根據(jù)苯酚、苯甲酸和對(duì)甲苯酸的洗脫來解釋這兩種不同的選擇性。甲醇的流動(dòng)相是緩沖液:甲醇(40:60),而乙腈的流動(dòng)相是緩沖液:乙腈(60:40)。使用的色譜柱是Shim-pack VP-ODS,在這種情況下,我們會(huì)發(fā)現(xiàn)用甲醇時(shí),苯酚首先洗脫,然后是苯甲酸,最后是對(duì)甲苯酸,但是在乙腈的條件下,會(huì)發(fā)現(xiàn)苯甲酸首先洗脫,然后是苯酚,最后是對(duì)甲苯酸。那么為什么用乙腈更容易洗脫苯甲酸呢?是什么使苯甲酸先于苯酚洗脫?
在這種情況下,我們需要了解苯甲酸與乙腈之間存在額外的相互作用,即與乙腈的碳氮三鍵和苯甲酸上的羰基氧上的π電子的π-π相互作用。因?yàn)榧状疾缓须娮?,因此這種π-π相互作用在甲醇中是不存在的,但在乙腈中卻很可能發(fā)生,并且由于這種額外的相互作用,苯甲酸將更喜歡存在于乙腈的流動(dòng)相中。因此,它將隨著流動(dòng)相一起流動(dòng),因此更快地洗脫出來。為什么對(duì)甲苯甲酸的保留時(shí)間較長(zhǎng)?烷基鏈的存在將疏水性帶入分子中,如果疏水性存在,則可以通過疏水相互作用與C18固定相發(fā)生相互作用?,F(xiàn)在,在苯酚、苯甲酸中沒有烷基鏈的存在,但是在對(duì)甲苯甲酸的情況下,有一個(gè)甲基鏈,這個(gè)甲基鏈帶來了一點(diǎn)疏水性,因此會(huì)與C18等疏水性固定相發(fā)生相互作用,這導(dǎo)致對(duì)甲苯甲酸與固定相之間有很好的相互作用,因此會(huì)保留更長(zhǎng)時(shí)間。
七、將乙腈&甲醇與緩沖液混合產(chǎn)生的沉淀
在反相液相色譜中,緩沖液與有機(jī)溶劑的流動(dòng)相混合使用,此時(shí)有機(jī)溶劑的濃度過高可能會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽沉淀。上表中,分別展示了常用緩沖液與乙腈或甲醇混合后是否會(huì)沉淀的情況。我們可以看到,對(duì)于某些緩沖液,無論使用哪種有機(jī)溶劑都不會(huì)發(fā)生沉淀,但通常情況下,在甲醇條件下產(chǎn)生沉淀的情況較少。
八、流動(dòng)相溶解度
梯度運(yùn)行顯示低重現(xiàn)性或失敗的一個(gè)常見原因可能與運(yùn)行高濃度緩沖液和高濃度有機(jī)溶液有關(guān)。而含有濃度小于10mM鹽溶液的水溶液/有機(jī)溶液在大多數(shù)梯度條件下不太可能沉淀(最多98%是有機(jī)溶劑,而不是100%),大多數(shù)與高效液相色譜應(yīng)用一起使用的緩沖溶液會(huì)有更高的鹽濃度,當(dāng)分析條件中有機(jī)溶劑含量較高時(shí)可能會(huì)從溶液中析出(導(dǎo)致堵塞,泄漏,插頭和不準(zhǔn)確的結(jié)果)。在反向色譜法中選擇有機(jī)組成時(shí)要謹(jǐn)慎。確保使用的溶液在所有濃度下都是穩(wěn)定的。還要驗(yàn)證緩沖能力是否仍然存在,當(dāng)使用高有機(jī)濃度時(shí)(當(dāng)緩沖液被稀釋時(shí))。不確定鹽是否會(huì)溶解?只要把同樣濃度的溶劑混合起來做測(cè)試就行了。觀察它,有任何渾濁或可見顆粒嗎?你就可以得到你需要的答案。甲醇總體上具有更好的溶解度特性(優(yōu)于乙腈),這意味著它在較高濃度下能更好地溶解大多數(shù)鹽,從而獲得更好的性能和更少的沉淀。
九、與水混合產(chǎn)生的反應(yīng)熱
當(dāng)甲醇與水混合時(shí),會(huì)放出熱量;甲醇與水混合時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱量,具有脫氣效果;
當(dāng)乙腈與水混合時(shí),會(huì)吸收熱量;隨著乙腈混合物逐漸回到室溫,液體中會(huì)產(chǎn)生氣泡;
配制水和甲醇混合物作為流動(dòng)相時(shí)需要的關(guān)注比乙腈更少。